干货收藏丨第二款TRK抑制剂『恩曲替尼』日本获批上市，临床NTRK应如何检测？
泛实体瘤靶向药目前上市有两款，
一款是TRK抑制剂，
另一款也是TRK抑制剂，
NTRK基因融合是其主要作用靶点，
那么，
关于NTRK基因融合检测，
临床有哪几种检测方法？
哪些人需要进行检测呢？
今天我们详细来说说...
第一款TRK抑制剂是 Loxo Oncology 公司的Vitrakvi（larotrectinib，拉罗替尼），2018年11月27日于美国上市，用于治疗携带 NTRK 基因融合的局部晚期或转移性实体瘤的成人和儿童患者。（2019年1月7日，礼来收购Loxo Oncology）。
第二款TRK抑制剂是 Ignyta（罗氏） 公司的Rozlytrek（Entrectinib，恩曲替尼），2019年6月18日于日本上市，用于治疗携带NTRK基因融合的晚期或复发性实体瘤患者。（2017年12月22日，罗氏收购Ignyta）。
▲ 恩曲替尼针对NTRK融合阳性患者的疗效结果：客观缓解率达到57.4%，对脑转移患者的颅内缓解率也达到了50%。
拉罗替尼和恩曲替尼（注意：都是坊间叫法，具体以国内上市时的药物名为准）都是不限癌种（实体瘤）、不限年龄、只看NTRK基因融合的广谱抗癌靶向药。
NTRK（NeuroTrophin Receptor Kinase）是神经营养因子受体络氨酸激酶。原肌球蛋白受体激酶（TRK）家族包括 TRKA、TRKB 和 TRKC 三种蛋白，它们分别由 NTRK1、NTRK2 和 NTRK3 基因编码，这些蛋白通常在神经组织中表达 。
▲ NTRK1/2/3基因编码的三种蛋白
NTRK基因融合促进了肿瘤的形成，NTRK基因融合将导致NTRK基因家族成员（NTRK1、NTRK2、NTRK3）与另一个不相关的基因融合在一起，其中NTRK基因的3'部分发生了包含催化酪氨酸激酶域，与相关基因5'部分的内框融合，驱动基因表达，促进蛋白二聚体化等变化，这与ALK和ROS1基因融合的致癌原理类似。TRK融合蛋白将处于持续活跃状态，引发永久性的信号级联反应（激活PI3K、RAS/RAF/MEK和PLC-gamma通路），驱动TRK融合肿瘤的扩散和生长。（点突变和扩增不是明确的致癌驱动因素，也不能根据现有数据预测TRK抑制剂的敏感性！）
▲ NTRK基因融合导致通路激活促进肿瘤发生
目前，NTRK基因融合的检测方法，主要有四种：IHC，FISH，RT-PCR及NGS（DNA/RNA）四种，下面我们来详细介绍下：
▲ NTRK四种检测方法优劣势及应用建议
① IHC检测NTRK基因融合：
优势：可以本地进行检测，出结果快，相对便宜。
缺点：使用组织进行检测，有显著的假阳性（FP）或假阴性（FN），需要专门的组织和多目标部位检测。
应用：可用于NTRK的筛查诊断，但推荐进一步证实NTRK基因融合。
▲ 美国商业化的NTRK IHC检测产品
② FISH检测NTRK基因融合：
优势：可以本地进行检测，出结果快。
缺点：对于检测结果的解释具有挑战性，NTRK阳性的标准cutoff值判断；使用组织进行检测，有显著的假阳性（FP）或假阴性（FN）；需要专门的组织和多目标部位检测。
应用：NTRK有3个基因，需检测多个位置的融合，需要进行多种FISH探针的检测，目前没有商业化的探针。
▲ IHC/FISH可快速出结果，可能在TRK融合频率高的癌症中有用
③ RT-PCR检测NTRK基因融合：
优势：快速、相对便宜。
缺点：不能检测未知的融合partners，（不）可能一次检测多种NTRK基因融合。
应用：需设计用于标识已知融合partners的断点。
④ NGS检测NTRK基因融合：
优势：灵敏度特异性高，可检测组织或血液。DNA-NGS检测各种融合的同时，可以获取基因突变的信息；RNA-NGS不存在内含子覆盖不到的问题，检测更准确。
缺点：成本高，检测周期较长。DNA-NGS的检测对一些内含子区域可能覆盖很低，检测到的融合可能表达，也可能不表达；RNA-NGS的检测高度依赖RNA的质量。
▲ DNA-NGS与RNA-NGS检测NTRK融合的差别
应用：RNA-NGS检测可能比DNA-NGS检测更可取，因为它可以识别出主动转录的NTRK嵌合融合。
▲ 美国商业化的NTRK NGS检测产品
2018年ESMO推荐NTRK基因融合检测策略：在已知具有高频率NTRK融合的特定类型肿瘤中利用FISH或RT-PCR方法直接确诊；而在NTRK基因融合发生率较低的肿瘤类型中，若条件允许可使用NGS的方法直接确诊，否则可先使用IHC的方法初筛而后使用NGS确诊。
▲ ESMO推荐NTRK基因融合检测策略（摄于南京易贸会议）
目前，NTRK已经写入非小细胞肺癌 2019 NCCN 指南，NCCN指南更新参考的《新英格兰医学杂志》对 NTRK 基因融合阳性患者（55例）的研究中（PMID：29466156），对NTRK基因融合的检测，使用的方法就是NGS（50例）和FISH（5例），可见NGS方法还是主流技术。
如果条件允许的情况下，小编还是建议用NGS方法来检测NTRK，不仅能检测NTRK的各种融合情况，还能检测TRK抑制剂拉罗替尼/恩曲替尼的耐药情况（见下图），一举两得。不仅可以检测组织，还可以检测血液哦~
▲ 一代NTRK抑制剂的耐药突变
首先，告诉大家的是NTRK基因融合的发生率情况：
在美国，所有肿瘤类型的NTRK基因融合总发生率约为：0.21%（11,116例患者的统计）；除去脑胶质瘤（2.8%），所有肿瘤的 NTRK 基因融合发生率仅为 0.1%；直观的数据显示，美国每年NTRK基因融合阳性的患者仅有 1500~5000 例。
在中国，所有实体肿瘤的NTRK基因融合总发生率约为：0.4%（至本医疗对5000多例患者的统计），虽然中国人口基数大，但是能有 NTRK 基因融合的人却不是很多。
所以，
到底哪些人才需要做NTRK基因融合检测?
1，在大多数情况下，致癌基因突变是相互排斥的，首先需要排除最常见的致癌基因突变，当所有实体瘤当不存在其他驱动癌基因突变时，都建议进行NTRK基因融合检测；
2，取决于肿瘤类型，不是所有的肿瘤都建议做NTRK基因融合，常见高频NTRK融合的肿瘤建议进行NTRK基因融合检测（不同肿瘤的NTRK基因融合发生率不同）：
先天性肾瘤、婴儿肉瘤、唾液腺癌（MASC）和分泌型乳腺癌的 NTRK基因融合发生率 > 90% ；（乳头状）甲状腺癌、胃肠道间质瘤肿瘤、Spitzoid肿瘤的 NTRK基因融合发生率位于 5% 和 25% 之间；其他多数肿瘤的 NTRK 基因融合发生率是 < 5% 的。
▲ 不同癌种的NTRK基因融合发生率
3，如果传统治疗方法能够治愈的患者，不太可能需要做NTRK基因融合检测，但是如果传统治疗方法的毒性太强或不可避免的情况下，建议进行NTRK基因融合检测；
4，认为适合系统治疗的患者，也建议进行NTRK基因融合检测（不要等到最后一分钟才决定检测，因为NTRK的基因检测可能需要2-4周）；
5，当没有有效的全身治疗方法时，也建议进行NTRK基因融合检测；
6，当标准疗法具有不可接受的毒性水平时（主观）；
7，虽然有理由在治疗后进展的患者中检测最新的样本，但NTRK基因融合可能从癌症开始就存在，而最初切除的肿瘤样本通常是足够的，所以在最初的肿瘤样本时，就可以进行NTRK基因融合检测；
8，在使用拉罗替尼/恩曲替尼治疗后出现疾病进展的患者，应进行NTRK基因检测进而确定耐药突变，如果有耐药突变，可尝试使用二代NTRK抑制剂LOXO-195。（泛癌种TRK抑制剂『拉罗替尼』等耐药后，使用LOXO-195更有效！）
▲ 一代NTRK抑制剂的耐药突变
参考资料：
1.https://www.roche.com/media/releases/med-cor-2019-06-18.htm
2.Cocco E, Scaltriti M, Drilon A. NTRK fusion-positive cancers and TRK inhibitor therapy[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018: 1.
3.J.S. Reis-Filho. Detecting MSI and TRK fusion using NGS: ESMO recommendations. ESMO, 2018.
4.Drilon Alexander,Laetsch Theodore W,Kummar Shivaani et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.[J] .N. Engl. J. Med., 2018, 378: 731-739.
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